荧光成像

基础知识

 

The Rayleigh Criterion

角分辨率

Numerical Aperture and Image Resolution交互动画

分辨率Resolution

几种超分辨率荧光显微技术的原理和近期进展

生物荧光成像技术介绍——多姿多彩的单、双光子成像技术

宽场落射荧光/激光共聚焦荧光显微成像

光学荧光成像(Optical Fluorescence Microscopy)：

• 多色标记；
• 动态成像，因为光相比于电子来说，对生物样品的损伤小很多，而且光学成像的时间分辨率很高，所以可以用光学荧光成像技术对活细胞或活生物样品进行长时间的观察，这样就可以捕捉动态的生命过程，比如细胞的分裂、迁移，药物进入细胞的机制以及进入后的动力学行为等等；
• 分辨率相对较低，艾里斑和点扩散函数的存在也会造成图像的模糊和清晰度的下降。

下面这几条都是荧光成像相关的基础知识，参考Fluorescence microscope—Wiki

光源：xenon arc lamp or mercury-vapor lamp are common; more advanced forms are high-power LEDs and lasers.

Multi-color image: The filters and the dichroic beamsplitter are chosen to match the spectral excitation and emission characteristics of the fluorophore used to label the specimen. In this manner, the distribution of a single fluorophore (color) is imaged at a time. Multi-color images of several types of fluorophores must be composed by combining several single-color images.

样品制备：In order for a sample to be suitable for fluorescence microscopy it must be fluorescent. There are several methods of creating a fluorescent sample; the main techniques are labelling with fluorescent stains or, in the case of biological samples, expression of a fluorescent protein. Alternatively the intrinsic fluorescence of a sample (i.e., autofluorescence) can be used. In the life sciences fluorescence microscopy is a powerful tool which allows the specific and sensitive staining of a specimen in order to detect the distribution of proteins or other molecules of interest. As a result, there is a diverse range of techniques for fluorescent staining of biological samples.

photobleaching: Photobleaching occurs as the fluorescent molecules accumulate chemical damage from the electrons excited during fluorescence. Photobleaching can severely limit the time over which a sample can be observed by fluorescence microscopy. Several techniques exist to reduce photobleaching such as the use of more robust fluorophores, by minimizing illumination, or by using photoprotective scavenger chemicals.

phototoxicity: Fluorescence microscopy with fluorescent reporter proteins has enabled analysis of live cells by fluorescence microscopy, however cells are susceptible to phototoxicity, particularly with short wavelength light. Furthermore, fluorescent molecules have a tendency to generate reactive chemical species when under illumination which enhances the phototoxic effect.

缺失未染色部分的信息：Unlike transmitted and reflected light microscopy techniques, fluorescence microscopy only allows observation of the specific structures which have been labeled for fluorescence. For example, observing a tissue sample prepared with a fluorescent DNA stain by fluorescence microscopy only reveals the organization of the DNA within the cells and reveals nothing else about the cell morphologies. Computational techniques that propose to estimate the fluorescent signal from non-fluorescent images (such as brightfield) may reduce these concerns. In general, these approaches involve training a deep convolutional neural network on stained cells and then estimating the fluorescence on unstained samples. Thus by decoupling the cells under investigation from the cells used to train the network, imaging can performed quicker and with reduced phototoxicity.

【落射荧光显微镜】(Epifluorescence Microscope)：是荧光显微镜的主要类型，生命科学领域使用尤其如此。落射荧光显微镜采用落射照明，如图所示：简单来说，分光镜反射短波，透射长波。短波长激发光在分光镜处反射，由物镜到样品，产生的长波长发射光经物镜返回，并透过分光镜。通常在样品处透射的激发光是反射光的千百倍。检测反射光相对来说，弱化了激发光对发射光的干扰。

【共聚焦显微镜】 (Confocal microscope)：是一种利用逐点照明和空间针孔调制来去除样品非焦点平面的散射光的光学成像手段，相比于传统成像方法可以提高光学分辨率和视觉对比度。早在上个世纪五十年代，美国哈佛大学的一位学者就提出了这个概念并且申请了专利，但是当时这个技术并没有引起人们的注意，主要不是因为这个技术不好，而是当时没有合适的光源(激光)以及很好的计算机能力去处理大量的图像数据。直到上个世纪九十年代，激光器、电脑、检测器等等的技术都比较成熟，此技术才逐渐被成为被广泛应用的显微成像技术。

从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体恰在焦点上，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦，简称共焦。共焦显微镜在反射光的光路上加上了一块二向色镜(dichroic mirror)，将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有【Pinhole】(针孔)，小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光电倍增管。可以想像，探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。其意义是：通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。

共聚焦显微镜的优点：(提高图像的分辨率、信噪比和图像质量。)

• 在共轭平面增加检测针孔，屏蔽非焦平面信号；
• 和普通的宽场(widefield)显微镜相比，有更窄的点扩散函数，以及更清晰更小的艾里斑；
• 不用手动切薄样品，就可实现光学切片，即通过逐层扫描就可以实现3D重构。

主要组件概述：

• 针孔：Confocal pinhole size =1 Airy Unit = Best signal to noise ratio，此时大约84%的聚焦光到达检测器；
• 激光光源：单色性好，能量强，虽然提高激光强度能提升荧光强度，但是也会对样品造成光漂白和光毒性，所以必须用合适的强度；
• 扫描振镜 (laser beam scanner)：，通过扫描振镜的高速摆动实现驻点扫描；
• PMT：将微弱的光信号转换成电信号的真空电子器件，放大倍数很高，实际操作中放大倍数的增加会同时增加所需信号以及背底噪音信号的强度，所以不宜太大，否则造成信噪比下降；
• 物镜 (Objective)：在波长一定的前提下，NA值对空间分辨率有决定性影响，而\(N A=n \cdot \sin \theta\)，因此高倍物镜多为水镜/油镜；亚细胞结构成像及共位分析建议使用高倍物镜(参考Resolution and Numerical Aperture)；
• 专用器皿：0.17mm玻璃底，优点有底面薄(高倍镜下，样品离物镜更近，可以更好地聚焦样品)、透光性好、折射率匹配、减少抗体等试剂的用量。

【光学切片】(Optical sectioning)：Optical sectioning is the process by which a suitably designed microscope can produce clear images of focal planes deep within a thick sample. This is used to reduce the need for thin sectioning using instruments such as the microtome. Many different techniques for optical sectioning are used and several microscopy techniques are specifically designed to improve the quality of optical sectioning. Good optical sectioning, often referred to as good depth or z resolution, is popular in modern microscopy as it allows the three-dimensional reconstruction of a sample from images captured at different focal planes. 

Optical Sections (Visualization of Thin Planes within a Bulk Sample，参考thorlabs)如上图。Signal generated by the sample is shown in green. Optical sections are formed by discretely measuring the signal generated within a specific focal plane. In confocal LSM, out-of-focus light is rejected through the use of a pinhole aperture, thereby leading to higher resolution. In multiphoton LSM (Laser Scanning Microscopy), signal is only generated in the focal volume. Signal collected at each optical section can be reconstructed to create a 3D image. 

【全内反射荧光显微镜】(Total internal reflection fluorescence microscope)：待补充

参考资料：
(1) IF imaging: Widefield versus confocal microscopy
(2) Widefield and Confocal Fluorescence Microscopy—Professor Dave Explains
(3) Confocal Microscopy—Quick Biochemistry Basics
(4) 生物荧光成像技术介绍——多姿多彩的单、双光子成像技术—北大

双光子显微成像

发展时间线：

• 实际上双光子最早在1931由波恩的学生Maria Goeppert Mayer提出；
• 1960年，美国科学家发明了第一台红宝石激光器(694.3 nm)，然后很多人使用这种激光器做各种实验，1961年Wolfgang Kaiser发现该红宝石激光器可以用来激发CaF₂:Eu²⁺，产生Eu²⁺的蓝光发射，即存在一个虚拟的中间态能级，只要激发光足够强，就可以实现双光子吸收过程，将Eu²⁺激发到常规的激发态；
• 1990年发明了第一台双光子显微镜Two-Photon Laser Scanning Fluorescence Microscopy-Science；
• 2015年，Two photon microscopy won  brain prize (神经科学届的诺贝尔奖)！表彰其发明、改进和使用双光子成像技术对神经细胞、轴突、神经元的活动进行精细的动态成像。

双光子现象：高光子密度情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子并发射出荧光。日常光照条件下，吸收单光子的频率是一秒一次，双光子是千万年一次。

Localization of excitation :

• Single-photon: an entire cone (线性吸收)
• Two-photon: only focal spot (非线性吸收) 双光子激发只发生在物镜焦点处，具有天然共焦小孔效应。

 

注：因为双光子在自然条件下很难发生，所以需要非常高能量的飞秒脉冲激光器，脉冲光的光毒性比较小。

生物的主要吸收体：

• 紫外区：蛋白和核酸；
• 可见光区：血红蛋白和黑色素；
• 近红外二区和远红外二区：水。

近红外激发(650 ~1300 nm)的优势：(参考Near-infrared window in biological tissue)

• 光吸收更少；
• 光散射更少；(The scattering coefficient spectrum of biological tissue)
• 穿透深度更深；(Effective penetration depth in breast tissue)
• 避免生物组织的autofluorescence。

共聚焦(confocal，单光子) vs 双光子显微成像：

• 共聚焦
  • 使用的是单光子成像，而激发光的波长是比较短的，容易被散射，因此到达焦平面的激发光变弱，背景荧光变强，光毒性大；
  • 短波长光一倍内源性物质吸收，造成光毒性；
  • 只有焦平面的发射光可以通过针孔；
  • 焦平面发射出的荧光可能发生散射，被针孔遮挡，信号丢失。
• 双光子：近红外激发光，较低的光散射和光吸收。

双光子成像的优势和应用：

• 优势：
  • 天然共聚焦小孔效应，因而信号利用率高，轴线层析能力强；
  • 激发波长更短，可实现深部组织观察，厚组织3D成像；
  • 单个光子能量小，因而光漂白、光损伤小，适合长时间及活体成像。
• 应用：神经科学研究，肿瘤研究，心脑血管相关研究，病毒学、炎症及免疫性疾病，神经退行性疾病，精神疾病，糖尿病等。

 

TR-FRET

【TRF】(Time-resolved fluorescence，时间分辨荧光)：使用荧光素等传统荧光基团检测荧光强度时，荧光素的发射半衰期很短，大约只有数纳秒。样品的激发和发射光的检测会同时进行。尽管微孔板读板机可以将发射光中的激发光筛选后有效去除，但这种激发光干扰、微孔板材质和待检测物质自发光等短半衰期光信号经常会干扰待检测荧光信号，导致高背景。

时间分辨荧光 (TRF) 通过使用铕或铽等能够发射长半衰期荧光信号的镧系元素作为荧光基团来降低背景信号值干扰。这种长半衰期荧光信号可持续数毫秒，因此可以使用脉冲光源(如氙闪灯）激发荧光基团，隔一段时间再进行发射信号检测(计数窗）。短半衰期荧光(仅持续数纳秒）在信号检测之前就会消失。使用时间分辨荧光进行测定可大大降低信噪比。最常使用的镧系元素是铕、铽和钐。这些镧系元素通常以螯合物或穴合物的形式应用以获得优质的信号强度和稳定性。

【TR-FRET】(Time-resolved fluorescence energy transfer)：TR-FRET结合了时间分辨荧光检测技术和荧光能量共振转移检测(FRET)技术。在FRET实验中，生物分子(如蛋白等）被荧光基团供受体标记。当生物分子之间相互作用，供受体荧光基团的距离被拉近。此时，若供体被激发，它会传递它的发射光能量给受体。受体和供体的发射光具有不同的波长，可以被微孔板读板机区分，从而定量生物分子之间的相互作用。

使用镧系元素荧光基团作为供体，发射光有很长的半衰期，TR-FRET可以利用时间分辨检测荧光，消除短半衰期背景荧光的干扰。在TR-FRET实验中，由于供体荧光基团发射光有较长半衰期，供受体荧光基团的激发和发射都可以在短半衰期背景荧光消失后再检测。

【均相检测】(Mix & Measure 检测)是化合物筛查中不可或缺的技术，具有实验过程简单、分析效率高的特点。一般的实验过程包括生物学“反应”过程、产物与未反应物和副产物的“分离”过程，以及对反应进程和抑制情况进行定量“测量”的过程。均相检测省去了“分离”步骤，主要使用微孔板来提高处理能力。然而，由于没有“分离”步骤，在“测量”过程中，通过“反应”生成的成分可能会残留下来，对测量结果造成某些影响。这是均相检测的一大问题。因此，为了最大程度降低这类影响，PerkinElmer将时间分辨(Time-Resolve)荧光检测与FRET检测相结合，开发出了TR-FRET检测。

无需“分离”步骤也可获得高灵敏度和低背景值的结果，原因在于：(参考镧系元素时间分辨荧光共振能量转移检测—PerkinElmer)

• 铕螯合物的荧光寿命非常长，FRET过程中受体的荧光寿命也较长。如此一来，当采用时间分辨荧光检测进行测定时，就可以避免样品中的杂质以及样品板材料等生成的短寿命背景荧光。
• 铕螯合物的激发光不会诱发受体发出荧光，因此，即使有残留的未反应受体分子，也不会检测到未反应的受体发出的荧光。
• 铕螯合物荧光光谱的峰形非常尖锐，几乎不与受体的检测光谱重叠，可将干扰降至最低。
• 由于斯托克斯位移较大，因此由激发光以及激发光的散射光引起的干扰非常小。
• 铕螯合物发出长波区域的红色荧光，受体也发出长波荧光。一般而言，化合物库中的大多数化合物都吸收短波长的光，或发出短波长的荧光。因此，使用长波区域荧光染料的LANCE与LANCE Ultra不易受到由其他化合物造成的猝灭或自体荧光的影响。

【HTRF】(Homogeneous Time Resolved Fluorescence)：是一种通用的TR-FRET技术，是对TR-FRET技术的进一步改良，提供了更高的灵敏度和稳定性，该技术由法国公司Cisbio发明，用于检测生物分子间的相互作用，HTRF®在美国和欧洲的TR-FRET技术市场中更是占据了50%以上的份额。虽然HTRF®也是基于TR-FRET的化学技术，但它的许多特点把它与其它TR-FRET产品区分开来。这些特点包括使用了镧系元素(铕和铽），从而具有非常长的半衰期，很大的Stroke's shift；同时，镧系元素与络合的穴相结合，这种结合的穴状物(Cryptate)与其它所有TR-FRET产品使用的螯合物结构(Chelate）相比，显著增加了稳定性(可耐受低pH值、金属离子、DMSO、EDTA等）；专利的比值测量能矫正淬灭和样品带来的干扰。穴状化合物的形成是将一个阳离子纳入到一个立体笼中。笼能收集光然后将能量转移到核心的镧系元素。大环的性质有利于跟镧系元素紧密相连，这种不可破的连接会形成异常稳固的复合体。

穴结构能耐受一些特殊的实验条件如大量存在的阳离子(Mg²⁺和Mn²⁺等）、螯合物(EDTA）、溶剂或者温度。从HTRF®能应用到临床诊断就能看出它也适用于浓度高的血清(50%）。在读板前或者孵育时加入氟离子能增强实验对大量化合物的抗干扰性。穴没有光漂白性，多次读数后信号没有损失，因此能按照需要的次数去读，所以可以进行动力学检测。而螯合物结构的稳定性还未达到这个水平。

总体而言，HTRF技术特点有：

• 荧光持续时间更久
• 时间选择(时间延迟读取测量）
• 低背景
• 校正干扰因素
• 均质式检测
• 能抵御金属离子对信号的影响

参考资料：
(1) TRF、TR-FRET 和 HTRF
(2) HTRF®技术介绍—丁香园
(3) 镧系元素时间分辨荧光共振能量转移检测—PerkinElmer
(4) fluorescence-spectraviewer (查询荧光基团光谱)

 

 

 

 

 

 

Time-gated optical imaging: Periodic excitation is usually triggered by high repetition pulsed lasers. Image acquisition triggered a determined delay time after the end of each laser pulse.  [资料]

这项技术的好处和特点：
(1) Time-gated optical imaging is an established stroboscopic technique, which can eliminate the nuisance of autofluorescence by exploiting the long lifetime of emissions from optical probes (∼μs–ms) against the short lifetime (∼ns) of tissue autofluorescence.
(2) This technique employs periodic laser pulses to perform light excitation, while the excitation train of pulses is synchronized, but with a precisely defined time delay (longer than the lifetime of the autofluorescence), with the activation of the camera. 

参考资料：
(1) 荧光寿命显微成像技术及应用的最新研究进展—物理学报(2018)
(2) 光电材料载流子动力学成像—金盛烨(蔻享)
(3) Continuous and discrete phasor analysis of binned or time-gated periodic decays-AIP advances-2021

STED

【STED】Stimulated emission depletion microscopy is one of the techniques that make up super-resolution microscopy. It creates super-resolution images by the selective deactivation of fluorophores, minimizing the area of illumination at the focal point, and thus enhancing the achievable resolution for a given system.

 

参考资料：
(1) 几种超分辨率荧光显微技术的原理和近期进展
(2) Microscopy: Super-Resolution Microscopy—庄小威

 

拉曼光谱

原子/分子的受激态是描述的电子的行为。因为原子/分子中具有各种分立的能级，所以电子从基态跃迁到激发态，就称之为被激发了。由于轨道量子化，原子中的电子不是想在哪里就可以在哪里的。因此，当从能量最低的轨道跃迁到能量较高的轨道的时候，原子/分子的整体能量提高了，处于激发态。这时候，电子是实实在在处于实实在在的能量比较高的原子/分子轨道上的。，更准确的说是受激虚态，是处于基态的粒子受到入射光子的激发，跃迁到了一个不稳定的虚拟的受激虚态，由于受激虚态极其不稳定，粒子很快又跃迁回基态，并且将吸收的能量以光子的形式释放出来，既为瑞利散射线。

对于瑞利散射、拉曼散射这一类拥有受激虚态的散射，原理和电子跃迁到激发态完全不同。在入射光的作用下，介质分子(原子）或者微粒可以看成次波源辐射光波，由于其无规性，在所有方向都有一定的散射光，这时候的瑞利散射的微观机制可以解释为电子受到光的电场作用，做受迫振动，类似于谐振子，处于高能态。但是这和轨道没有关系，和实实在在的原子/分子能级也没有任何关系，但是的确处于由入射光让电子处于高于基态的能态，因此称之为受激虚态。

【虚态】(virtual state)：In quantum physics, a virtual state is a very short-lived, unobservable quantum state.The concept is quite general and can be used to predict and describe experimental results in many areas including Raman spectroscopy, non-linear optics generally, various types of photochemistry, and nuclear processes.

 

 

瑞利散射

尺寸远小于光波长的微小颗粒 —【Rayleigh scattering】Most photon incidents on a molecule undergo Rayleigh scattering at the same wavelength as the incident light.

• 弹性碰撞/散射，无能量交换/损耗，仅改变方向，mostly isotropic；
• 偶极子在光场中的受迫振动，振动的电偶极子辐射同频电磁波；
• 瑞利散射光的强度和入射光波长的四次方成反比\(I(\lambda)_{\text {scattering }} \propto \displaystyle\frac{I(\lambda)_{\text {incident }}}{\lambda^4}\)。

瑞利非偏振散射光强度：$$I=I_0 \displaystyle\frac{8 \pi^4 \alpha^2}{\lambda^4 R^2}\left(1+\cos ^2 \theta\right)$$其中\(I_0\)表示入射光强度，\(\theta\)为入射光与散射光的夹角。

天空蓝色：白天，尤其太阳在头顶时，当太阳光经过大气层时，与半径远小于可见光的波长的空气分子(N₂、N₂、H₂O、CO₂等)发生瑞利散射，因为蓝光比红光波长短，瑞利散射较激烈，被散射的蓝光布满了整个天空，从而使天空呈现蓝色。而紫光虽然波长较蓝光更短，散射较激烈，能量也较高，但因人眼对蓝色的敏感度远大于紫色，所以天空看起来仍是蓝色。

正午太阳白色：此时太阳在我们头顶正上方，太阳光直射，大量的太阳光都可以穿透大气层到达地面，所以你就会感觉到太阳光各种波长都有，最终呈现的就是白光。换句话说此时看到的太阳光多为直射光而非散射光。

日出或日落的时太阳是红色：此时太阳在斜前方，它发出的光就会经过很厚很厚大气层才能到达人的眼睛。在大气层比较厚的时候，它就会不停地散射，短波长比如说蓝光它就散射掉了，还剩下能被人眼看到的光主要就是长波长的红橙光。云朵也因反射太阳光而呈现红橙色，而天空则呈现较为昏暗的蓝黑色。

月球的天空黑色：即使在白天也是黑的，因为其并无大气层，缺乏瑞利散射所致。

 

【丁达尔效应】(Tyndall effect)：在光的传播过程中，光线照射到粒子时，如果粒子大于入射光波长很多倍，则发生光的反射；如果粒子小于入射光波长，则发生光的散射，这时观察到的是光波环绕微粒而向其四周放射的光，称为散射光或乳光。丁达尔效应就是光的散射现象或乳光现象。由于溶胶粒子大小一般不超过100 nm，胶体粒子介于溶液中溶质粒子和浊液粒子之间，其大小在1～100nm。小于可见光波长（400 nm～700 nm），因此，当可见光透过溶胶时会产生明显的散射作用。而对于真溶液，虽然分子或离子更小，但因散射光的强度随散射粒子体积的减小而明显减弱，因此，真溶液对光的散射作用很微弱。此外，散射光的强度还随分散体系中粒子浓度增大而增强。所以说，胶体能有丁达尔现象，而溶液几乎没有，可以采用丁达尔现象来区分胶体和溶液。

按照Wiki-Tyndall effect，并没将丁达尔效应归因于瑞利散射，但是提到it is similar to Rayleigh scattering, in that the intensity of the scattered light is inversely proportional to the fourth power of the wavelength, so blue light is scattered much more strongly than red light.

 

米氏散射

尺寸大于光波长的颗粒 —【Mie scattering】is a phenomenon in which the light of all colors is scattered evenly regardless of the wavelength due to particle sizes that are larger than the incident wavelengths of lights. For particle sizes larger than a wavelength (灰尘，水滴，来自污染物的颗粒物质，如烟雾等), Mie scattering predominates. This scattering produces a pattern like an antenna lobe (天线波瓣), with a sharper and more intense forward lobe for larger particles，即大部分的入射光线会沿着前进的方向进行散射(Anisotropic: mostly forward scattering)。

当然了颗粒尺寸不能过大，否则直接表现为反射了。

 

拉曼散射

【Raman scattering】However, a few photons (比例非常低)  scatter inelastically, where the wavelength of the scattered light changes due to the interaction with the molecules.

• 强度比瑞利散射低3~5个数量级。
• 非弹性碰撞；有能量交换且改变方向。
• 斯托克斯拉曼散射的比例大于反斯托克的，因为后者对应于处在高vibrational state的分子，所以大部分的拉曼光谱仪都是测Stokes线的。这里有点类似Mn⁴⁺在氟化物中的发光，既有ZPL(说的是激发光和发射光波长相同的那个ZPL，因为Mn⁴⁺中有多个ZPL，对应不同能级的跃迁)，又有斯托克斯和反斯托克斯发光。
• 鉴定组成或者结构的原理：When Raman scattering occurs, the wavelength of the incident light shifts due to the difference in the intrinsic vibrational energy of the molecule. Each molecule has a specific vibrational energy, such that this frequency difference has its own value. Therefore, the composition or structure of a chemical can be confirmed through Raman scattered light.

几十年来，拉曼光谱技术在实际应用中并未得到充分利用。这主要归因于以下两点：

• 拉曼信号相对较低，Although the non-resonance Raman instrumentation has been greatly improved both mechanically and optically, its scattering efficiency is still intrinsically poor. Typically only 1 in 10⁶ ~10⁸ photons undergo inelastic Raman scattering resulting in limited sensitivity and long spectral collection times.
• 荧光干扰，这取决于分析物分子的性质和所用的激发波长。荧光比拉曼散射效率高得多，因此可以完全淹没拉曼信号。

【Resonance Raman spectroscopy】(共振拉曼光谱，RRS)：在普通拉曼光谱中，中间态不是分子的本征态(通常是个虚拟态)，使吸收和散射的几率都很小。在共振拉曼光谱中，由于激发光源频率落在被照射分子的某一电子吸收带以内，使虚拟态变成了本征态，从而大大增加了分子对入射光的吸收强度。

RRS的特点，补充

红外活性 vesus 拉曼活性

小木虫：简谐振动的活性有两种，一种对应红外活性，一种对应拉曼活性，红外活性的简振模式偶极矩发生变化，拉曼活性电子云极化率发生变化……A B 是群论符号，具体请看《群论在化学中的应用》这本书，讲的比较详细。

拉曼光谱和红外光谱都是研究分子的振动和转动，但其产生的机理却是不同的。红外光谱又叫分子振动转动光谱，它是研究极性基团和非对称分子，由其振动或转动引起偶极矩的变化，此时。补充，百度

ustc

应用：

参考资料：
(1) 涨知识！拉曼光谱32个常见问题汇
(2) Probing cellulose structures with vibrational spectroscopy
(3) hyperphysics
(4) Surface-Enhanced Raman Scattering (SERS) in Microbiology: Illumination and Enhancement of the Microbial World